生物絮团技术对异育银鲫生长性能和抗性的影响

为研究生物絮团技术(Biofloc Technology,BFT)在沿海滩涂鱼类养殖中的应用效果,本实验以滩涂主要养殖种类——异育银鲫(Carassius auratus gibelio)为研究对象,按照BFT养殖模式(BFT组,不换水,只补存蒸发掉或取样部分的水分)和一般养殖模式(对照组,每日换水1次,每次换水1/4~1/3)分别饲养,测定各处理组异育银鲫的生长指标、消化酶活性和免疫相关酶活性,应用实时荧光定量PCR法定量分析热休克蛋白HSP70的相对表达,人工感染试验对比分析BFT养殖模式组和一般养殖模式组异育银鲫生长性能和抗性的变化。结果显示:(1)BFT组异育银鲫增重率、特定生长率和存活率均高于对照组(P0.01),肥满度、脏体比和肝体比与对照组间无显著差异(P0.05);(2)BFT组异育银鲫肠道中淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶活性显著高于对照组(P0.05),分别提高了53.10%、28.10%和17.99%;(3)BFT组异育银鲫体表黏液中超氧化物歧化酶活性、血清中总抗氧化能力和溶菌酶活性高于对照组(P0.01);(4)BFT组脾、肾、肝和鳃中热休克蛋白HSP70的表达量分别上调了1.29倍、1.34倍、1.87倍和1.68倍;(5)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)人工感染试验证实,BFT组异育银鲫抗细菌感染能力显著增强。研究表明,BFT养殖模式适于异育银鲫养殖,可促进鱼体生长,增强其应激能力和抗病力。     

鱼源维氏气单胞菌的研究进展

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种可感染包括鱼类、人类在内的多种动物的革兰阴性菌，尤以水生变温动物为甚。此病原菌中的某些菌株致病性较强,可以导致感染该菌的鱼类表现出多种病症，如败血症等，严重时会导致死亡。该菌当前已在全球包括我国在内的部分地区对水产养殖造成了较大经济损失。综述了维氏气单胞菌的研究进展和新进报道，旨在报道维氏气单胞菌的分类地位、毒力因子、耐药性等特征，为水产养殖中防治此类细菌病提供新思路，并勘正当前对维氏气单胞菌部分毒力因子的同物异名现象。     

Exogenous polyunsaturated fatty acids (PUFAs) influence permeability,antimicrobial peptide resistance,biofilm formation and membrane phospholipid structure in an A-layer and non-A-layer strain of Aeromonas salmonicida

Aeromonas salmonicida is a Gram-negative bacterium that can infect a wide host range of fish populations, including salmonids and non-salmonids as well as freshwater and marine life. Some strains of A. salmonicida cause the disease furunculosis, which can cause lethargy, intestinal inflammation, ulcers, haemorrhaging and death. The infection is spread through fish-to-fish contact, and the presence of infection can have devastating effects on cultivated fish populations. The purpose of this study was to explore the ability of non-A-layer and A-layer A. salmonicida strains to incorporate polyunsaturated fatty acids (PUFAs) into their lipid profile and test the phenotypic effects thereof. Lipids were extracted from PUFA-exposed cultures and analysed for lipid modification by thin-layer chromatography and ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry, showing A. salmonicida, regardless of A-layer, capable of incorporating all seven of the PUFAs studied. Phenotypic effects were determined through the use of assays that tested for biofilm formation, membrane permeability and cyclic peptide susceptibility. Temperature-dependent effects on biofilm formation were observed, and PUFA exposure showed significant (p < .001) increases in membrane permeability as tested by the uptake of the hydrophobic compounds crystal violet and ethidium bromide. Additionally, some PUFAs elicited modest protection and vulnerability against the membrane-targeting cyclic peptides polymyxin B (PMB) and colistin. The diverse, strain-specific responses to exogenous PUFAs may allude to evolved adaptive strategies that enhance survival, persistence and virulence of non-pathogenic and pathogenic members of bacteria that oscillate between environmental and fish host niches.     

过氧化氢酶高产菌株CE-2-A的发酵条件优化

为了提高气单胞菌属菌株CE-2-A的过氧化氢酶产量,对其发酵条件进行优化。首先运用了单因子试验筛选出了发酵培养基的麦芽糖含量、牛肉膏含量、CaCl2和MgCl2含量,在此基础上采用Plackett-Burman设计法,对8种影响产酶的因素进行评价。试验结果表明,牛肉膏含量、起始pH、摇瓶装液量对菌株产过氧化氢酶的活力具有显著的影响。通过Box-Behnken试验考察了牛肉膏含量、起始pH、摇瓶装液量这3个主要因素对菌株所产过氧化氢酶活力的影响。发酵条件优化结果为装液量42.6ml、牛肉膏含量3.69g/L、起始pH9.1,采用优化后发酵培养条件进行摇瓶发酵培养,过氧化氢酶的酶活力达到2532.5U/ml,与优化前酶活力(1849.7U/ml)相比提高了36.9%。     

aguA基因缺失对嗜水气单胞菌致病性的影响

嗜水气单胞菌是水环境常见的病原体,具有较强致病性。在本研究中,首次敲除了嗜水气单胞菌aguA基因,通过转录组分析发现aguA敲除后细菌的粘附、致病、胺代谢等生物过程下降。通过qRT-PCR进一步验证发现10个粘附基因、9个发病基因和8个胺代谢基因的mRNA表达水平明显下降；此外,转录组水平分析结合qRT-PCR验证发现VI型分泌系统基因、II型分泌系统基因、鞭毛合成相关基因、菌毛合成相关基因、溶血基因、I型分泌系统基因、肠毒素基因、RTX基因等毒力基因的RNA表达水平也出现下调。对两株菌进行草金鱼的体内感染实验,与野生菌株相比,aguA敲除株感染草金鱼的致病力降低了7.47倍,且aguA敲除株生物膜形成能力降低了16.6%。以上结果显示aguA基因与嗜水气单胞菌的致病性密切相关。     

秦皮素的抑菌作用及其对嗜水气单胞菌毒力的影响

为探讨中草药单体秦皮素对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)生长和毒力的影响,实验测定了秦皮素对嗜水气单胞菌最低抑菌浓度(MIC)、生长曲线、生物膜以及脂肪酶活性、运动性、蛋白酶活性和溶血性等毒力相关因子的影响。结果表明,秦皮素对嗜水气单胞菌具有明显的抑制效果, MIC为128μg/mL;秦皮素浓度大于16μg/mL时,对嗜水气单胞菌的生物膜形成有显著促进作用(P0.05);秦皮素浓度大于8μg/mL时,对嗜水气单胞菌的脂肪酶活性有显著降低作用(P0.05);秦皮素浓度为2～8μg/mL时,对嗜水气单胞菌的运动性和溶血性无显著影响(P 0.05),但能降低嗜水气单胞菌蛋白酶活性(P0.05)。秦皮素对嗜水气单胞菌有一定的抑菌作用,但期望通过低浓度秦皮素实现对嗜水气单胞菌的防治仍有待进一步研究。     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

鱼源嗜水气单胞菌质粒的指纹图谱及其与耐药性的关系

为了解国内各地嗜水气单胞菌的耐药性、质粒指纹图谱及质粒大小与其耐药性之间的关系,分离、收集了40株不同时期来源于国内各地的鱼源嗜水气单胞菌,通过KB纸片法检测对29种抗生素的耐药性,碱裂解法小量提取质粒后,采用限制性内切酶EcoRⅠ及HindⅢ对质粒DNA进行酶切并对质粒菌株采用溴化乙锭消除处理,通过琼脂糖凝胶电泳获得质粒指纹图谱,研究质粒与耐药性的关系。试验结果显示,嗜水气单胞菌耐药情况严重,且多重耐药普遍;40株嗜水气单胞菌的质粒检出率为37.5%;质粒指纹图谱与耐药相关性分析表明,嗜水气单胞菌的耐药性与所携带质粒的数量和大小无直接关系,来源相同、耐药类型相似的菌株质粒图谱及酶切质粒图谱相似;质粒消除试验发现质粒消除率为100%,但都只能消除部分质粒;其中12株菌部分耐药表型消失,提示质粒和染色体分别编码耐药基因,2.01 kb的质粒与该菌对萘啶酸、万古霉素的耐药性有关。     

异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测

2008年10月江苏盐城大丰精养异育银鲫（Carassius auratus gibelio) 发生严重疾病，从病鱼肝脏、血液及腹水中分离到优势生长的细菌。对分离做纯培养的4株菌(JY081016-1至JY081016-4)进行形态特征、理化特性等表型生物学性状检验；测定了菌株（JY081016-1）的16S rRNA和gyrB基因序列，分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性，并构建了系统发生树。结果表明分离菌对供试健康异育银鲫有强致病性，菌株（JY081016-1）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1448bp（GenBank 登录号：GQ232759），所扩增的gyrB基因序列长度为1177bp（GenBank 登录号：GQ232760），其16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上；根据分离菌的表型及分子特征，判定分离鉴定的4株菌为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）。胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶，在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血；设计的特异性引物可扩增出溶血素基因。     

含嗜水气单胞菌气溶素的免疫刺激复合物的制备及其对欧洲鳗的免疫效果

将嗜水气单胞菌气溶素(AerA)基因定向连接到pET-32a(+)表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），SDS-PAGE分析表明，硫氧还蛋白-气溶素融合蛋白（Trx-AerA）表达量占重组菌总蛋白量的65.5%。将上述融合蛋白与商品化的QuilA混合，分别添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇获得Trx-AerA ISCO Ms。其中同时添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇组蛋白质回收率最高为10.46%，仅添加QuilA组蛋白回收率为1.82%，两者差异显著（P＜0.05）。分别采用Trx-AerA、Trx-AerA ISCOMs、Trx ISCOMs经腹腔注射免疫欧洲鳗，免疫30d后，每个实验组取5尾实验鱼采集血清，按1：200稀释通过ELSIA法检测抗体水平，同时采用菌数为2.0×106CFU的嗜水气单胞菌ZN1株进行攻击，测定免疫效力。结果显示：Trx-AerA免疫组相对保护率为0%（3/15），Trx-AerA ISCOMs免疫组为83.3%（13/15），Trx ISCOMs免疫组为50%（9/15）； 3个免疫组针对气溶素的特异性抗体水平OD450值分别为0.19，0.52，0.36，Trx-AerA ISCOMs免疫组、Trx-AerA免疫组显著高于Trx ISCOMs免疫组（P＜0.05）。结果表明影响嗜水气单胞菌免疫效力的除了气溶素的抗体水平外，ISCOMs等也能够增强非特异性免疫保护应答。